流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)方法

1. 流式細(xì)胞儀的概述

流式細(xì)胞儀由液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和分析系統(tǒng)四部分組成。測(cè)量原理是鞘液和樣品流在噴嘴附近組成個(gè)圓柱流束，與水平方向的激光束垂直相交，染色的細(xì)胞受激光照射后發(fā)出熒光或產(chǎn)生散射光，這些信號(hào)分別被光電倍增管熒光檢測(cè)器和光電二極管散射光檢測(cè)器接收，經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)儲(chǔ)存、計(jì)算、分析這些數(shù)字化信息，就可得到細(xì)胞的大小、活性、核酸含量、酶和抗原的性質(zhì)等物理和生化指標(biāo)。主要應(yīng)用于分析細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)、細(xì)胞受體、腫瘤細(xì)胞的DNA、RNA含量等方面。

2. 術(shù)語(yǔ)

等量可溶性熒光分子（MESF）：顆粒發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)度相當(dāng)?shù)目扇苄詿晒馑胤肿拥奈镔|(zhì)的量濃度。用于表示顆粒發(fā)出的熒光信號(hào)強(qiáng)度。

3.流式細(xì)胞儀校準(zhǔn)

（1）環(huán)境條件

室溫為（15~30）℃，室內(nèi)相對(duì)濕度：≤70%。

（2）校準(zhǔn)使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

a.  單一熒光強(qiáng)度的熒光微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；

b.  多重?zé)晒鈴?qiáng)度混合熒光微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；

c.  計(jì)數(shù)熒光微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；

d.  淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

注：校準(zhǔn)時(shí)應(yīng)采用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，相對(duì)擴(kuò)展不確定度不超過(guò)20% (k=2)。

（3）校準(zhǔn)項(xiàng)目

a.  外觀檢查

b.  分辨力

c.  線性相關(guān)系數(shù)

d.  檢出限

e.  漂移

f.  重復(fù)性

g.  示值誤差

（4）外觀檢查

用目測(cè)、手動(dòng)法進(jìn)行檢查。

（5）分辨力校準(zhǔn)

a.  儀器經(jīng)預(yù)熱，進(jìn)入正常工作狀態(tài)；

b.  在裝有0.5 mL經(jīng)過(guò)0. 22 μm濾膜過(guò)濾的磷酸鹽緩沖液的試管中，移取0.5 mL單一熒光強(qiáng)度的熒光微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，充分混勻后上機(jī)實(shí)驗(yàn)；

c.  記錄前向角散射光和488 nm激發(fā)下兩個(gè)熒光通道，包括綠色熒光（FITC 異硫氰酸熒光素）、橙紅色熒光（PE藻紅蛋白）；

d.  收集門內(nèi)有效信號(hào)10000個(gè)，計(jì)算前向角散射光和兩個(gè)熒光通道中校準(zhǔn)微球峰寬的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，即為分辨力。

（6）線性相關(guān)系數(shù)校準(zhǔn)

a.  在裝有1mL經(jīng)過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾的磷酸鹽緩沖液的試管中加入20μL多重?zé)晒鈴?qiáng)度混合熒光微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，充分混勻后上機(jī)實(shí)驗(yàn)；

b.  記錄488 nm激發(fā)下綠色熒光（FITC）、橙紅色熒光（PE）通道信號(hào)；

c.  對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直方圖分析，熒光強(qiáng)度從低到高至少5種不同的熒光強(qiáng)度峰，每個(gè)峰收集10000個(gè)門內(nèi)有效信號(hào)，得到每個(gè)峰的平均熒光強(qiáng)度；

d.  根據(jù)校準(zhǔn)微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書提供的各個(gè)峰的等量可溶性熒光分子（MESF），將各峰的MESF取對(duì)數(shù)lg（MESF），簡(jiǎn)化表示為y，各峰測(cè)量的平均熒光強(qiáng)度取對(duì)數(shù)lg（FITC）或lg（PE），簡(jiǎn)化表示為x，將兩者線性回歸得到方程y=kx+b，計(jì)算兩個(gè)通道的線性相關(guān)系數(shù)（r）。

（7）檢出限校準(zhǔn)

a.  針對(duì)綠色熒光（FITC）和橙紅色熒光（PE）熒光通道，采用線性相關(guān)系數(shù)中得到的線性回歸方程y=kx+b；

b.  計(jì)算無(wú)熒光標(biāo)記的空白微球的平均熒光強(qiáng)度值對(duì)應(yīng)的MESF即為熒光檢出限。

（8）漂移校準(zhǔn)

a.  將周圍環(huán)境溫度控制在允許范圍（設(shè)定溫度±3℃）內(nèi)，在裝有1 mL經(jīng)過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾的磷酸鹽緩沖液的試管中，加入數(shù)滴單色熒光微球標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，充分混勻后上機(jī)試驗(yàn)；

b.  記錄前向角散射光和488 nm激發(fā)下綠色熒光（FITC）、 橙紅色熒光（PE）通道的信號(hào)，收集10000個(gè)以上門內(nèi)有效信號(hào)；

c.  測(cè)試完成后，利用直方圖分析試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)微球的平均熒光強(qiáng)度值；

d.  連續(xù)開機(jī)2 h后，在相同流式細(xì)胞儀設(shè)置和熒光通道電壓值的條件下重復(fù)前述試驗(yàn)步驟，得到標(biāo)準(zhǔn)微球的平均熒光強(qiáng)度值；

e.  計(jì)算相對(duì)漂移率來(lái)表示穩(wěn)定性。

（9）重復(fù)性校準(zhǔn)

a.  首先制備取100 μL淋巴細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按比例添加抗原決定簇CD4抗體，輕柔渦旋充分混勻，避光存放半小時(shí)，使CD4抗體與細(xì)胞充分結(jié)合；

b.  將淋巴細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)記好CD4抗體后上機(jī)測(cè)試，收集10000個(gè)以上門內(nèi)有效信號(hào)；

c.  重復(fù)測(cè)量6次，依次記錄每次測(cè)量的CD4陽(yáng)性細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的百分比，計(jì)算CD4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量占總淋巴細(xì)胞的百分比的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，作為重復(fù)性的評(píng)價(jià)。

（10）      示值誤差校準(zhǔn)

按照測(cè)量重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中得到的CD4陽(yáng)性細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的百分比，計(jì)算平均值，然后計(jì)算示值誤差，最后評(píng)估示值誤差校準(zhǔn)不確定度。

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