技術(shù)文章
TECHNICAL ARTICLES熒光定量PCR儀校準(zhǔn)方法與結(jié)果情況
實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀特異性更強(qiáng),自動(dòng)化程度更高,且有效地解決了PCR污染的問(wèn)題,應(yīng)用領(lǐng)域及應(yīng)用量都不斷增加。但其設(shè)計(jì)更為復(fù)雜,溫度模塊和光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)同時(shí)影響其性能和實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性,為定量PCR儀校準(zhǔn)帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。采用生物試劑等方式對(duì)定量PCR儀熒光部分校準(zhǔn)缺乏溯源性,無(wú)法分析誤差來(lái)源,存在較大缺陷。
PCR儀操作簡(jiǎn)單、靈敏度高,被廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)中。但傳統(tǒng)PCR儀不能準(zhǔn)確定量,操作過(guò)程中易污染使得假陽(yáng)性率高等缺陷。熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)控整個(gè)PCR反應(yīng)過(guò)程,最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。這一技術(shù)特異性更強(qiáng),自動(dòng)化程度更高,且有效地解決了PCR污染。
因此,實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀逐步取代普通PCR儀在臨床檢驗(yàn)、檢驗(yàn)檢疫、法醫(yī)鑒定、疾病控制、體外診斷試劑制造和研發(fā)、生物技術(shù)產(chǎn)品研發(fā)等領(lǐng)域得到了更為廣泛的應(yīng)用。熒光定量PCR儀在普通PCR儀的技術(shù)上增加了熒光激發(fā)裝置和檢測(cè)系統(tǒng),包含激發(fā)光光源、濾光片、鏡頭和熒光檢測(cè)器等。檢測(cè)系統(tǒng)有超低溫CCD成像系統(tǒng)和光電倍增管PMT。
熒光定量PCR儀光學(xué)校準(zhǔn)方法與結(jié)果分析的性能起到?jīng)Q定性控制作用,共同決定最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。因此,對(duì)定量PCR儀的校準(zhǔn)需求也逐步從單純的溫場(chǎng)校準(zhǔn)轉(zhuǎn)向溫度加熒光的復(fù)合參數(shù)校準(zhǔn)。
1,熒光定量PCR儀校準(zhǔn)現(xiàn)狀
相對(duì)于傳統(tǒng)PCR儀,熒光定量PCR儀的影響因素更為復(fù)雜,主要因素包含化學(xué)試劑、溫度模塊的溫度因數(shù)、頂蓋溫度因數(shù)、鏡頭、反光鏡和光路通道、熒光接收器的敏感度、機(jī)械組成部分、熒光信號(hào)處理軟件的閾值設(shè)定,如基線,基線設(shè)定,S/N比例探測(cè)等,這就為熒光定量PCR儀的校準(zhǔn)帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。
國(guó)內(nèi)校準(zhǔn)機(jī)構(gòu)目前針對(duì)熒光定量PCR儀的校準(zhǔn)主要分為兩種情況:
一種是僅對(duì)熒光定量PCR儀的溫場(chǎng)部分進(jìn)行校準(zhǔn),這種方法無(wú)法對(duì)熒光定量PCR儀光學(xué)部分進(jìn)行校準(zhǔn),所獲得的結(jié)果不能對(duì)熒光定量PCR儀的性能進(jìn)行全面評(píng)估;
另外一種方法是利用化學(xué)試劑對(duì)熒光定量PCR儀的進(jìn)行熒光檢測(cè),這種方法同樣存在極大缺陷。首先采用化學(xué)方法對(duì)定量PCR儀熒光系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn),無(wú)法溯源到任何*的標(biāo)準(zhǔn),不具備溯源性。其次,梯度稀釋試劑的過(guò)程中由于人為操作會(huì)引入一定的誤差,誤差值可能較大,直接影響到最終的檢測(cè)結(jié)果。最重要的是,采用這種方法進(jìn)行校準(zhǔn),無(wú)法說(shuō)明熒光定量PCR儀的溫度和熒光對(duì)最終定量結(jié)果的影響關(guān)系,誤差多少及誤差來(lái)源等。
隨著定量PCR儀的應(yīng)用越來(lái)越廣泛,使用者迫切需要對(duì)熒光定量PCR儀的性能進(jìn)行評(píng)估。在現(xiàn)有檢測(cè)手段無(wú)法滿(mǎn)足需求的情況下,熒光定量PCR儀使用者普遍采用兩種方式自行對(duì)儀器狀態(tài)進(jìn)行判斷,一種是使用生物試劑測(cè)試盤(pán)這種檢測(cè)方法和采用已知濃度的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)樣本線性誤差進(jìn)行校準(zhǔn)的方法都屬于化學(xué)方法,這種方法僅能夠針對(duì)孔與孔間的組合線性進(jìn)行測(cè)量,所得結(jié)果僅能代表PCR儀孔與孔間的平均結(jié)果,不能代表單孔的線性,無(wú)法真實(shí)反映儀器的性能。另一種方法是采用多臺(tái)不同廠家或型號(hào)定量PCR儀實(shí)驗(yàn)比對(duì)的方式來(lái)比較不同儀器間的系統(tǒng)誤差,判斷系統(tǒng)誤差是否在臨床接受范圍內(nèi)。這種方法既不具備溯源性,又需要對(duì)單個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行實(shí)驗(yàn)比對(duì),成本較高。
影響定量PCR儀結(jié)果重復(fù)性的2個(gè)主要原因是邊緣效應(yīng)和實(shí)驗(yàn)誤差,而邊緣效應(yīng)是由于光路設(shè)計(jì)缺陷和控溫模塊缺陷導(dǎo)致的。如果光路設(shè)計(jì)存在缺陷,會(huì)導(dǎo)致PCR儀樣品槽的邊緣孔和中間孔光程存在差異,不同反映孔間熒光基團(tuán)獲得的激發(fā)光能量存在差異,最終影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí),加熱模塊的空間溫差同樣會(huì)導(dǎo)致這種邊緣效應(yīng),研究表明,孔間溫差的微小差別可能在基因擴(kuò)增的過(guò)程中被指數(shù)級(jí)放大,最終影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。此外,光路設(shè)計(jì)缺陷和孔間溫差的存在還會(huì)直接影響到熔解曲線的結(jié)果,使得不同儀器對(duì)熔解曲線的分辨率存在明顯差異。在通過(guò)熔解曲線檢測(cè)突變或進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性分析時(shí),這種影響會(huì)導(dǎo)致無(wú)法成功區(qū)分突變基因或誤判突變基因。
因此,對(duì)定量PCR儀更加全面科學(xué)的校準(zhǔn)方式是采用可溯源物理手段同時(shí)對(duì)熒光定量PCR儀的溫度部分和光學(xué)部分進(jìn)行校準(zhǔn),并分析二者之間的聯(lián)系,以保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
2,定量PCR儀光學(xué)校準(zhǔn)系統(tǒng)
基于上述定量PCR儀校準(zhǔn)需求,本文采用Cyclertest3Doptical定量PCR儀光學(xué)校準(zhǔn)系統(tǒng)對(duì)定量PCR儀的溫場(chǎng)和熒光系統(tǒng)進(jìn)行全面校準(zhǔn)。系統(tǒng)在原有的PCR儀溫度校準(zhǔn)系統(tǒng)基礎(chǔ)上運(yùn)用可溯源光譜理論,將溫度和熒光檢測(cè)相結(jié)合,模擬定量PCR儀試驗(yàn),不僅可以對(duì)溫度模塊、上蓋溫度進(jìn)行檢測(cè),還能同時(shí)對(duì)熒光系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè),并分析而二者的相關(guān)性,更準(zhǔn)確地確定定量PCR儀誤差及誤差來(lái)源。
前端傳感器示意圖檢測(cè)系統(tǒng)鑲嵌經(jīng)校準(zhǔn)并可用光譜儀溯源的發(fā)光LEG,通過(guò)給定電流量的不同會(huì)產(chǎn)生不同區(qū)強(qiáng)度的熒光模擬標(biāo)準(zhǔn)熒光激發(fā),并通過(guò)對(duì)熒光激發(fā)部分的溫度控制。
這種設(shè)計(jì)避免了光譜的漂移,保證LEG的激發(fā)光在運(yùn)行過(guò)程中保持絕對(duì)的同一水平,這種采用物理手段進(jìn)行檢測(cè),避免了人為操作引入的誤差,更加準(zhǔn)確。這種熒光檢測(cè)方法通過(guò)了國(guó)際認(rèn)證,運(yùn)用了可溯源光譜理論,可溯源溫度計(jì)量來(lái)對(duì)熒光定量PCR進(jìn)行*的檢測(cè),系統(tǒng)根據(jù)溯源性、可靠性和準(zhǔn)確性。
系統(tǒng)溫度部分可以對(duì)定量PCR儀的溫度準(zhǔn)確度、孔間溫差、實(shí)時(shí)升溫速率、實(shí)時(shí)降溫速率、溫度過(guò)沖、溫度持續(xù)時(shí)間、上蓋溫度進(jìn)行校準(zhǔn)。熒光部分可以對(duì)定量PCR儀的Cq(Ct)相差值、精確度、熒光飽和值、熒光線性、熔解曲線精確度及一致性,熔解溫度的比例關(guān)系及線性靈敏度等進(jìn)行檢測(cè)。
公司背景介紹:
華譜&澤恒是專(zhuān)注于為生物制藥行業(yè)提供實(shí)驗(yàn)室儀器計(jì)量校準(zhǔn)、GMP驗(yàn)證服務(wù)/3Q驗(yàn)證/設(shè)備確認(rèn)/廠房驗(yàn)證的專(zhuān)業(yè)服務(wù)商。我們給制藥客戶(hù)解決的是一站式QC/QA/工程/驗(yàn)證等事業(yè)部的質(zhì)控外包服務(wù)。
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