目的  采用40層細(xì)胞工廠(40-layer cell factory, CF40)工藝培養(yǎng)原代地鼠腎(primary hamster kidney, PHK)細(xì)胞，優(yōu)化乙腦減毒活疫苗的生產(chǎn)工藝。

方法  用不同濃度新生牛血清培養(yǎng)不同接種密度PHK細(xì)胞，比較各組PHK細(xì)胞數(shù)量，確定CF40工藝的PHK細(xì)胞接種密度和新生牛血清濃度。通過(guò)對(duì)比CF40和15 L轉(zhuǎn)瓶采用不同新生牛血清的PHK細(xì)胞培養(yǎng)情況，比較兩種工藝對(duì)新生牛血清的選擇性。對(duì)4個(gè)廠家CF40培養(yǎng)的PHK細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行單因素方差分析，判定對(duì)CF40的選擇性。

結(jié)果  CF40工藝的*條件為PHK細(xì)胞接種密度6.1×10⁵ ml^-1、新生牛血清濃度6%。CF40工藝對(duì)新生牛血清的選擇性較低，能比轉(zhuǎn)瓶工藝更穩(wěn)定地培養(yǎng)更多的PHK細(xì)胞。4個(gè)廠家CF40培養(yǎng)的PHK細(xì)胞數(shù)量之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.23，P＞0.05），對(duì)CF40選擇性低。

結(jié)論  采用CF40可以制備出滿足乙腦減毒活疫苗生產(chǎn)要求的PHK細(xì)胞。

流行性乙型腦炎（乙腦）是經(jīng)蚊蟲傳播的急性神經(jīng)系統(tǒng)傳染病^[1-2]，全球每年報(bào)告約68 000 例乙腦病例，病死率約為30％，且在幸存者中，30％～50％會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)和精神方面的后遺癥^[3]。目前較為有效的預(yù)防方法是接種乙腦減毒活疫苗，且大量臨床研究證明乙腦減毒活疫苗具有良好的免疫原性和安全性^[4-5]。隨著國(guó)家對(duì)預(yù)防用生物制品質(zhì)量和生產(chǎn)工藝要求的逐漸提高，企業(yè)應(yīng)采用可控性強(qiáng)、操作便利、節(jié)約生產(chǎn)成本和空間的生產(chǎn)工藝制備疫苗^[6]。

目前，乙腦減毒活疫苗采用的是15 L轉(zhuǎn)瓶工藝，而乙腦病毒單一病毒收獲液的收量取決于原代地鼠腎（primary hamster kidney, PHK）細(xì)胞的質(zhì)量，由于轉(zhuǎn)瓶工藝受控于人為因素較多，因此本試驗(yàn)采用40層細(xì)胞工廠(40-layer cell factory, CF40)工藝培養(yǎng)PHK細(xì)胞，并對(duì)各關(guān)鍵工藝參數(shù)及材料進(jìn)行優(yōu)化，以制備符合生產(chǎn)要求、一致性更好的PHK細(xì)胞。

PHK細(xì)胞由成都生物制品研究所有限責(zé)任公司（成都公司）病毒性疫苗一室使用成都公司動(dòng)物室提供的10~14日齡黃金地鼠〔許可證號(hào)SCXK（川）2021-126〕制備。

新生牛血清分別購(gòu)自蘭州榮曄生物科技有限責(zé)任公司、山西潤(rùn)生大業(yè)生物材料有限公司、呼和浩特市草原綠野生物工程材料有限公司和美國(guó)Gibco公司，109培養(yǎng)基由成都公司配制，胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司， CF40分別購(gòu)自美國(guó)Corning公司、Nunc公司、FeiFanT公司和DHS公司；520 DI／REL蠕動(dòng)泵購(gòu)自斯派莎克工程（中國(guó)）有限公司，SHXJ-VIG(J)25瓶位轉(zhuǎn)瓶機(jī)購(gòu)自蘭州飛控儀器總廠生化設(shè)備制造廠，Countstar IC1000全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購(gòu)自上海睿鈺生物科技有限公司，XDS-1B倒置顯微鏡購(gòu)自重慶重光實(shí)業(yè)有限公司。

將消化后的PHK細(xì)胞加入含不同濃度新生牛血清和0.1 mg /ml谷氨酰胺的109液體培養(yǎng)基，配制成為細(xì)胞懸液，添加NaHCO₃調(diào)節(jié)pH至約7.4。共配制6組細(xì)胞懸液，PHK細(xì)胞接種密度分別為4.5×10⁵、5.2×10⁵、6.1×10⁵、6.8×10⁵、7.3×10⁵、8.2×10⁵ ml^-1，每組3瓶，新生牛血清濃度分別為3%、6%、9%。將上述細(xì)胞懸液分別分裝約8 000 ml到Corning CF40中, 放入36~38 ℃孵室連續(xù)培養(yǎng)3 d，使用破窗錘將細(xì)胞工廠拆分成多個(gè)單層，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并以全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。如果存在幾個(gè)結(jié)果近似的較優(yōu)新生牛血清濃度與PHK細(xì)胞接種密度的組合，則用這些組合重復(fù)試驗(yàn)，并以全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)組合試驗(yàn)6次，選出*組合。

分別使用不同廠家、同一廠家不同批號(hào)或不同廠家混合的新生牛血清制備8組細(xì)胞懸液，每組2瓶，1瓶約8 000 ml，含6%新生牛血清，PHK細(xì)胞接種密度為6.1×10⁵ ml^-1，轉(zhuǎn)入到1個(gè)Corning CF40；另1瓶約14 000 ml，含8%新生牛血清， PHK細(xì)胞接種密度為4.7×10⁵ ml^-1，平均分裝到7個(gè)15 L轉(zhuǎn)瓶。將CF40和15 L轉(zhuǎn)瓶放入36~38 ℃孵室連續(xù)培養(yǎng)3 d，以全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，對(duì)比兩種工藝對(duì)新生牛血清的選擇性。

制備含6%新生牛血清，接種密度為6.1×10⁵ ml^-1的PHK細(xì)胞懸液，分別分裝到Corning、Nunc、FeiFanT、DHS的CF40中，體積均約8 000 ml，36~38 ℃孵室連續(xù)培養(yǎng)3 d，以全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，比較各廠家的CF40對(duì)培養(yǎng)PHK細(xì)胞的適用性，每種CF40均測(cè)定9次。

使用Excel 2016軟件對(duì)不同PHK細(xì)胞接種密度、不同新生牛血清濃度在CF40上培養(yǎng)的PHK細(xì)胞數(shù)量繪制折線圖分析；使用SPSS Statistics 25.0軟件對(duì)兩個(gè)較優(yōu)組合培養(yǎng)出的PHK細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分別計(jì)算CF40和15 L轉(zhuǎn)瓶使用不同新生牛血清培養(yǎng)的PHK細(xì)胞數(shù)量的方差與極差，比較兩種工藝對(duì)新生牛血清的選擇性；使用SPSS Statistics 25.0軟件對(duì)不同廠家CF40培養(yǎng)的PHK細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

由表1和圖1可知，CF40中最佳PHK細(xì)胞接種密度為6.1×10⁵ ml^-1，6%、9%新生牛血清明顯優(yōu)于3%新生牛血清。對(duì)PHK細(xì)胞接種密度為6.1×10⁵ ml^-1時(shí)，6%、9%新生牛血清培養(yǎng)出的PHK細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行 t 檢驗(yàn)，t = -0.37，P =0.722。在最佳PHK細(xì)胞接種密度下，6%、9%新生牛血清培養(yǎng)出的PHK細(xì)胞數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從生產(chǎn)成本上考慮，確定*組合為6.1×10⁵ ml^-1細(xì)胞接種密度與6%新生牛血清濃度。

CF40使用不同新生牛血清培養(yǎng)的PHK細(xì)胞數(shù)量，標(biāo)準(zhǔn)差s₁=0.06×10⁹，極差R₁=0.15×10⁹，均值x?₁=2.04×10⁹；15 L轉(zhuǎn)瓶使用不同新生牛血清培養(yǎng)的PHK細(xì)胞數(shù)量，標(biāo)準(zhǔn)差s₂=0.29×10⁹，極差R₂=0.77×10⁹，均值x?₂=1.44×10⁹。s₁＜s₂，R₁＜R₂，說(shuō)明CF40培養(yǎng)的PHK細(xì)胞數(shù)量波動(dòng)更??；x?₁＞x?₂，說(shuō)明CF40培養(yǎng)的PHK細(xì)胞數(shù)量更多。綜上，CF40工藝對(duì)新生牛血清的選擇性較低，使用各廠家、批號(hào)的新生牛血清均能培養(yǎng)出數(shù)量比15 L轉(zhuǎn)瓶工藝多的PHK細(xì)胞，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

對(duì)4個(gè)廠家CF40培養(yǎng)的PHK細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行單因素方差分析，F=0.23，P=0.873。表明4個(gè)廠家CF40培養(yǎng)出的PHK細(xì)胞數(shù)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即PHK細(xì)胞對(duì)CF40的選擇性不高，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

乙腦病毒屬于胞外病毒，病毒在細(xì)胞內(nèi)完成復(fù)制組裝成熟之后會(huì)通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入到病毒維持液中，只需輕輕晃動(dòng)就可以收集單一病毒收獲液，這也是使用細(xì)胞工廠制備乙腦減毒活疫苗的天然優(yōu)勢(shì)。與15 L轉(zhuǎn)瓶工藝相比細(xì)胞工廠有較大的優(yōu)勢(shì)，比如操作簡(jiǎn)單、節(jié)省空間、可控性好、靜止培養(yǎng)更利于細(xì)胞貼壁以及提高PHK細(xì)胞生產(chǎn)的一致性等，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于疫苗的生產(chǎn)和研發(fā)^[7]。

新生牛血清在PHK細(xì)胞培養(yǎng)中起到十分重要的作用，它能終止胰蛋白酶消化，提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的貼壁因子、促生長(zhǎng)因子、免疫球蛋白、胰島素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)^[8]。目前市場(chǎng)上血清種類繁多，不同廠家及同一廠家不同批次血清質(zhì)量存在差異，選擇合適的血清對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)尤為重要^[9]。本試驗(yàn)采用了不同廠家或同一廠家不同批號(hào)或不同廠家混合的新生牛血清培養(yǎng)PHK細(xì)胞，試驗(yàn)結(jié)果表明，CF40工藝對(duì)新生牛血清的選擇性低，這可能是和細(xì)胞工廠本身的制造工藝和培養(yǎng)方式相關(guān)，細(xì)胞工廠培養(yǎng)表面經(jīng)過(guò)特殊處理，大大提高了細(xì)胞的吸附性，加之采用靜止培養(yǎng)方式，對(duì)新生牛血清中的貼壁因子要求不高^[10]。綜合CF40工藝新生牛血清濃度和對(duì)血清的選擇性，每亞批CF40使用約500 ml新生牛血清能穩(wěn)定地培養(yǎng)出約2.0×10⁹ PHK細(xì)胞，而15 L轉(zhuǎn)瓶工藝每亞批使用約1 100 ml新生牛血清，培養(yǎng)出的PHK細(xì)胞數(shù)目波動(dòng)較大且遠(yuǎn)少于CF40工藝。

綜上，CF40工藝可以穩(wěn)定地培養(yǎng)出比15 L轉(zhuǎn)瓶工藝更多的PHK細(xì)胞，滿足乙腦減毒活疫苗生產(chǎn)需求，相比于目前不可控因素較多的轉(zhuǎn)瓶，不論是生產(chǎn)過(guò)程控制還是產(chǎn)品質(zhì)量方面都會(huì)有提高。